к.б.н. Покровская М.С.,
чл.-корр. РАМН, проф. Смирнов Г.Б.
(НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН и АО «ЛАГИС»)

Введение

Давно и хорошо известно, что для того, чтобы вылечить больного, нужно знать, чем именно он болен. Процесс определения типа болезни называется диагностикой. Диагноз при любой болезни ставит врач (на основании изучения анамнеза, наблюдения клинических проявлений и анализа данных лабораторных исследований), после чего назначает лечение. В наши дни при постановке диагноза врач использует данные лабораторных исследований, без которых поставить правильный диагноз либо затруднительно, либо в ряде случаев вообще невозможно.

Значение диагностики как процесса распознавания болезней состоит в том, что ранний, точный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исхода заболевания.

При диагностике инфекционных болезней, в т.ч. ЗППП важно выявить этиологический фактор (возбудителя) и установить стадию заболевания, то есть получить сведения необходимые для выбора этиотропной и адекватной терапии, предсказать ход болезни и сроки её завершения.

Характерными чертами современной лабораторной диагностики являются постоянная разработка новых и совершенствование известных методов и приёмов. Это обусловлено тем, что в последние десятилетия наблюдается непрерывное изменение как клинической картины инфекционных заболеваний, так и особенностей их патогенеза. Например, известные достаточно опасные возбудители могут вызывать стёртые формы болезней или наоборот: условно-патогенные или считавшиеся непатогенными микроорганизмы становятся причиной тяжелых форм. Меняется тропность патогенных микроорганизмов (поражают другие органы и ткани) и, как следствие, появляются новые формы инфекционных процессов. Возникают хронические, персистирующие формы инфекций и изменяется антигенная структура возбудителей, микроорганизмы переходят в некультивируемой состояние. Отклонения от классических форм протекания инфекционных заболеваний и возникновение атипичных форм связаны с двумя обстоятельствами. Во-первых, у части населения изменилось состояние иммунной системы, стали распространенными иммунодефицитные состояния различной природы. Во-вторых, меняются сами возбудители инфекций. То есть, мы являемся свидетелями эволюционного процесса у микроорганизмов.

Все это затрудняет диагностику и отрицательно сказывается на эффективности лечения. Роль использования современных методов лабораторных исследований для постановки диагноза становится в настоящее время весьма значительной.

Для диагностики инфекционных болезней используются различные лабораторно-инструментальные методы, среди которых важнейшее место занимают специфические методы, имеющие целью выявить возбудителя заболевания и установить, таким образом, этиологический диагноз.

Предметом данного сообщения являются избранные разделы лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Основные понятия и методы лабораторной диагностики инфекций

Ключевыми показателями лабораторной диагностики являются чувствительность и специфичность методов выявления возбудителей инфекций (грибов, простейших, бактерий и вирусов).

• Чувствительность - это минимальное количество материала, которое можно выявить данным методом. Материалом могут быть целые микроорганизмы и фрагменты молекул возбудителей, а также специфические антитела, выработанные человеческим организмом в ответ на инфекцию. Чем меньше материала способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Если лабораторное исследование не выявляет микрорганизмы, которые присутствуют в образце и для выявления которых разработана тест-система, результат называется ложно-отрицательным. Чем выше чувствительность метода, тем меньше ложно-отрицательных [ложно(-)] результатов.
• Специфичность - это способность метода указывать на наличие в образце только того объекта, для выявления которого была разработана тест-система. Если метод указывает на наличие в образце микроорганизмов, которые там не содержатся, результат называется ложно-положительным. Чем выше специфичность метода, тем меньше ложно-положительных [ложно (+)] результатов.

  Все методы лабораторной диагностики можно разделить на две группы: методы прямого и непрямого выявления микроорганизмов.

• Прямые методы названы так потому, что выявляют непосредственно возбудителей инфекций или материал, входящий в состав возбудителя, или им продуцируемый. Обычно это антигены или генетический материал. К числу прямых методов относятся следующие (табл. 1):

  Таблица 1. Прямые методы лабораторной диагностики
  Методы	Принцип метода	Специфичность	Чувствительность
  Микробиологический	Выделение чистой культуры возбудителя	100% “золотой стандарт” лабораторной диагностики	1 000-10 000 кл/ мл
  Цитологический (микроскопия)	Исследование окрашенных мазков	20-80%	1 000-100 000 кл/ мл
  Иммуноцитологический и серологический	Выявление антигенов после связывания с антителами РИФ, ИФА	70-90%	1 000-100 000 кл/ мл
  Молекулярно-биологический	Определение специфического участка ДНК/ РНК в геноме возбудителя	99-100% приравнивается к “золотому стандарту”	200 кл/мл (1 клетка в реакции)

  Ложно(+) результаты связаны в случае цитологического метода с субъективностью оценки результатов, в случае иммунологических методов - с перекрестным реагированием антигенов с антителами.

  Ложно(-) результаты в прямых методах могут быть обусловлены недоступностью возбудителя во время забора клинического материала, для микробиологического метода - гибелью микроорганизма в процессе транспортировки образца и в случае некультивируемой формы.

• Непрямые методы названы так потому, что выявляют материал не самого возбудителя, а специфические антитела, выработанные человеком в ответ на инфекцию данного типа, т.е. являются иммунологическими. К таким методам относятся: реакция связывания комплимента (РСК), реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), реакция микроиммунофлуорес ценции (МИФ), рекомбинантный липополисахаридный ИФА (r - ELISA), иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность этих методов - 1000-100000 кл/мл.

  При использовании иммунологических методов практически во всех случаях ложно(+) результаты связаны с неспецифическим связыванием антител с антигенами или перекрёстным реагированием антигенов с антителами. Ложно(-) результаты возникают из-за недостаточного количества специфических антител или антигенов в пробе и недостаточной чувствительности методов определения.

  Несмотря на значительные успехи современной лабораторной диагностикой ни один метод на практике не гарантирует сочетания 100% чувствительности и специфичности. А значит не дает 100% верного ответа. Поэтому для постановки диагноза врачу нередко необходимо использовать минимум два различных метода, причем каждое исследование лучше проводить в двух- или трёхкратном повторении. Это является требованием при диагностике таких болезней, как туберкулёз, хламидиоз и ряда других (1).

Диагностическое значение выявления иммуноглобулинов классов А, М, G

Остановимся подробнее на серологической диагностике (определение антител в сыворотке крови методом ИФА). Она основывается на определении очень специфических антител (АТ), образующихся в организме человека в ответ на присутствие микроорганизмов - возбудителей инфекций. Эти АТ представляют собой иммуноглобулины (Ig) классов М, А, G. Антитела нейтрализуют инфекционные агенты, взаимодействуя с антигенами. Антиген - это специфическая часть инфекционного агента (микроорганизма), которая вызывает в человеческом организме образование специфических антител (иммунный ответ). Основой серологических реакций является специфическое взаимодействие антиген-антитело. Рассмотрим, что дает для постановки диагноза выявление АТ классов IgM, IgA, IgG (Табл. 2).

Таблица 2. Определение стадии инфекционного заболевания по результатам исследования антител в сыворотке крови методом ИФА
Стадия (форма) заболевания	Антитела в порядке появления в сыворотке крови	Динамика титров (в интервале 2-3 недели)
Острая при первичном инфицировании	IgM ⇒ IgG ⇒ IgA или - IgM ⇒ IgA ⇒ IgG ⇒ ранние или предранние IgG	Нарастание титров или снижение (IgM после 7-го дня), - в зависимости от времени, прошедшего с начала развития инфекции
Вторичное инфицирование и реактивация (рецидив)	IgG ⇒ IgA, почти полное отсутствие IgM ⇒ ранние или предранние IgG	Быстрое нарастание или снижение титров
Хроническая	IgG ⇒ IgA, иногда только IgA или только IgG	Постоянные невысокие титры, могут быть постоянно высокими - в случае тяжелой восходящей инфекции или системных поражений.
Персистенция, носительство	IgA или IgG	Постоянные (несколько недель) низкие титры (АТ не всегда выявляются из-за изменённой антигенной структуры микроорганизмов)
Давно перенесённая болезнь	IgG	Стабильно низкие титры

Количественное определение антител различных классов помогает определить стадию и характер течения заболевания. При трактовке количественных результатов необходимо учитывать, что иммунный ответ человеческого организма на развитие инфекции и уровень вырабатываемых им антител зависят от особенностей возбудителей, стадии инфекционного процесса и индивидуальных особенностей иммунной системы. В случае выраженной иммуносупрессии синтез АТ может быть полностью подавлен. Поэтому для постановки диагноза, особенно при атипичных формах протекания инфекций, врач не может однозначно трактовать количественный результат одного исследования.

Для правильной оценки результатов количественного выявления антител к различным инфекционным агентам необходимо пользоваться принципом парных сывороток (повторение исследования через 2-3 недели и сравнение результатов). Такие исследования дают возможность проанализировать динамику выявления антител и, таким образом, получить необходимую информацию о развитии инфекционного процесса. Четырехкратное нарастание антител за 2-3 недели свидетельствует о развитии инфекции.

Именно для того, чтобы была возможность провести такие парные исследования и нужны количественные результаты ИФА.

Традиционный путь определения острой инфекции - выявление в сыворотке крови IgM. Современные диагностические тест - системы позволяют выявлять кроме IgM другие ранние антитела, такие как: 1) IgG к предранним белкам вирусов и 2) низкоавидные IgG. Причем IgG к предранним белкам вирусов являются маркерами как первичной острой инфекции, так и рецидива (обострения хронической инфекции) и реинфекции, т.е. всех вариантов острой инфекции, в отличие от IgM, вырабатывающихся, как правило, только при первичной инфекции.

Полимеразная цепная реакция

Введение в практику медицинской микробиологии молекулярных методов диагностики стало, безусловно, знаменательным событием, так как оно радикально расширило возможности изучения патогенеза заболеваний, принципиально усовершенствовало диагностику и даже обозначило новые подходы к лечению. Всё более распространённым становится метод молекулярной диагностики, основанный на ПЦР, дающей оптимальное сочетание высокой чувствительности и специфичности.

Молекулярная диагностика, вообще, и ПЦР в частности, основаны на определении наличия в исследуемом образце специфических нуклеиновых кислот, чаще всего ДНК.

ДНК - двунитевая (двуцепочечная) полимерная молекула, последовательность нуклеотидов в которой и определяет все свойства организма. При делении клеток ДНК удваивается, и в каждую из двух дочерних клеток попадает точная копия генетического материала родительской клетки. Удвоение молекулы ДНК называется репликацией. На двух исходных (матричных) цепях ДНК строятся новые дочерние цепи (комплементарные матричным). Репликация обеспечивается ферментативным комплексом, ключевым элементом которого является ДНК-полимераза. Для того, чтобы ДНК-полимераза сумела начать репликацию ей, помимо матрицы, необходима затравка (праймер) - небольшой фрагмент ДНК, комплементарно связанный с матрицей. Эту затравку ДНК-полимераза как бы удлиняет, строя новую цепь ДНК на имеющейся матрице. В норме в природе реплицируется вся ДНК, находящаяся в клетке или вирусе, и продуктом этого процесса являются две идентичные копии исходной ДНК.

Теперь, когда мы вкратце вспомнили самое главное о репликации, можно перейти к описанию полимеразной цепной реакции. ПЦР была открыта в 1983 году и в настоящее время широко применяется для научных и практических исследований, в области диагностики инфекционных и генетических заболеваний, ранней диагностики некоторых онкологических патологий. За открытие этого метода Кэри Мюллис в 1995 году был награжден самой престижной научной наградой - Нобелевской премией.

В ходе этой реакции тоже реплицируется ДНК, но не так, как обычно в природе. Во-первых, реплицируется не вся ДНК микроорганизма, а только ее небольшой фрагмент (мишень).

Во-вторых, продуктом ПЦР являются не две, а миллионы копий исходной мишени. Такая многократная репликация называется амплификацией.

У разных родов и видов бактерий, а также у вирусов, генетические тексты (нуклеотидные последовательности ДНК) различаются. Современные компьютерные программы содержат банк данных о расшифрованных последовательностях ДНК различных организмов. При разработке диагностической ПЦР-тест-системы находят небольшой фрагмент ДНК (мишень), строго специфичный для конкретного возбудителя. С помощью ПЦР амплифицируют именно этот участок и затем идентифицируют продукт амплификации (ампликон) методом электрофореза в агарозном геле.

Выявляя специфический для данного микроорганизма фрагмент ДНК, тем самым определяют микроорганизм.

Каждый цикл диагностики инфекций проходит в три стадии (рис.):

1. Денатурация - расплетение цепей двунитевой ДНК - не ферментативный процесс, который идет при температуре 95 0 С.
2. Присоединение (отжиг) праймеров. Для начала процесса репликации в ПЦР используют праймеры - короткие одноцепочечные ДНК (длиной 15-30 оснований), которые добавляют в избытке в реакционную смесь. Они специфично (по принципу комплементарного спаривания) присоединяются к коротким участкам, ограничивающим выбранную мишень. Эта стадия не является ферментативной и проходит в процессе инкубации реакционной смеси при 55-65 0 С. Праймеры присоединяются только к выбранным специфичным для данного возбудителя фрагментам ДНК и не взаимодействуют ни с какими другими последовательностями ДНК (а в клинической пробе очень много ДНК, как человека, так и различных микроорганизмов). Именно этим обеспечивается абсолютная специфичность диагностической ПЦР-тест-системы. Избыточное количество ДНК праймеров по отношению к матричной ДНК обеспечивает высокую чувствительность метода. То есть праймеры в исходном для ПЦР растворе со 100% вероятностью найдут мишень для присоединения.
3. В результате присоединения праймеров образуются структуры [ДНК-матрица + праймер], являющиеся «затравочными» комплексами. Начинается достраивание праймеров, начиная с 3’-концов, путём комплементарного синтеза на матрицах одноцепочечных фрагментов ДНК. Этот процесс осуществляется с помощью специального фермента - Taq-полимеразы (термоустойчивой ДНК-полимеразы) и нуклеотидов (в качестве строительного материала).

   Вновь синтезированные двуцепочечные ДНК после стадии денатурации снова связывают праймеры, которые находятся в смеси в избытке . Полученные структуры после достраивания образуют специфические фрагменты ДНК, ограниченные последовательностями праймеров. Таким образом, даже если исходной для ПЦР была только одна молекула ДНК, то в течение 25 - 40 циклов происходит амплификация, т.е. синтезируется большое количество (108-109 копий) специфических фрагментов ДНК (ампликонов), достаточное для визуального учета результата реакции после электрофореза в агарозном геле.

ПЦР проводят в циклаторе или амплификаторе - приборе, в котором циклично автоматически выполняется заданный режим смены температур, позволяющий многократно последовательно проходить 1, 2, 3 стадии.

Учёт реакции проводят с помощью электрофореза в агарозном геле. Отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся в геле под действием электрического поля от катода к аноду, при этом длина пробега фрагментов ДНК за определенный промежуток времени зависит от их размера. ДНК в геле окрашивают бромидом этидия, что делает ее видимой в ультрафиолетовом свете. Если в исследуемой пробе в результате ПЦР накопились ампликоны (фрагменты ДНК одинакового размера), то они окажутся на одном расстоянии от старта и будут видны как полоса на гелевой дорожке. Если положение полосы на гелевой дорожке соответствует расчётной для использованной пары праймеров, т.е. находится на том же расстоянии от старта, что полоса положительного контроля, то это означает, что результат исследования положительный.

Как и в каждом эксперименте при учёте результатов ПЦР предусматривают контроли - положительный и отрицательный. Любая диагностическая тест-система должна иметь утверждённый регламент, который включает наличие упомянутых контролей.

Положительный контроль - это образец с ДНК-матрицей для накапливания специфического ампликона, соответствующего определяемому микроорганизму.

Отрицательный контроль - вода, ДНК человека или ДНК микроорганизмов, близкородственных определяемому данной тест-системой.

Достоинства метода ПЦР

ПЦР диагностика является одним из наиболее современных и совершенных лабораторных диагностических методов, позволяющий специфично выявлять ДНК единичных клеток возбудителей инфекционных заболеваний в образце.

Есть принципиальное отличие методов молекулярной диагностики, включая ПЦР, от любых других традиционных методов. Это отличие состоит в том, что традиционные методы выявляют продукты деятельности генов микроорганизмов (белки, антигены и более сложно организованные признаки), тогда как ПЦР выявляет непосредственно генетический материал. Таким образом, микроорганизм обнаруживается методом ПЦР в независимости от особенностей функционирования генома, каких-то атипичных проявлений.

Можно сказать, что ПЦР достигает предельно возможной чувствительности. Чувствительность ПЦР-тест-систем составляет 10-1000 клеток в пробе, в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических методов - 1000-100000 клеток в пробе. Благодаря высокой чувствительности, тест-системы на основе ПЦР незаменимы в тех случаях, когда исследуемого материала (возбудителя заболевания) очень мало.

Благодаря высокой чувствительности исследование методом ПЦР позволяет осуществлять раннюю диагностику заболеваний (например, во время профилактических осмотров населения), уточнять диагноз на фоне антибиотикотерапии, проверять излеченность (эффективность проведенного лечения), а также обнаруживать персистирующие микрорганизмы. Для некоторых возбудителей, таких как Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, чувствительность диагностических ПЦР-тест-систем не должна быть высокой. Специально разрабатываются и утверждаются показатели чувствительности, начиная с 105-6 клеток в мл. Такие тест-системы выявляют диагностически значимое количество этих микроорганизмов (2,3).

При выявлении трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов только прямой метод, выявляющий ДНК возбудителя, дает необходимый диагностический ответ. Другие способы диагностики (иммунологические, бактериологические, микроскопические) затруднены или даже невозможны. В случае персистирующих микроорганизмов это может быть связано с изменениями в антигенной структуре возбудителей или с переходом таких микроорганизмов в некультивируемую форму. Об этом необходимо помнить при диагностике латентных и хронических инфекций.

Высокая специфичность метода ПЦР задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми при создании ПЦР-тест-системы условиями их присоединения к специфическому строго для данного возбудителя фрагменту ДНК (мишени). В зависимости от выбранных праймеров ПЦР-тест-система может дифференцировать роды, виды, серотипы и даже патогенные и непатогенные штаммы микроорганизмов одного вида.

С помощью ПЦР диагностики инфекций можно определять чувствительность (или устойчивость) возбудителей ко многим из применяемых антибиотикам. Это особенно актуально в тех случаях, когда микробиологический метод исследования применить невозможно.

Для ПЦР-анализа пригоден любой клинический материал, потенциально содержащий возбудителей инфекций - кровь, сыворотка, лаважная жидкость, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы. Исследуемым материалом могут быть пробы с объектов внешней среды (смывы, отпечатки, мазки, вода, почва и т.д.).

ПЦР является унифицированным и автоматизированным методом, что позволяет стандартно выдерживать регламент, утвержденный в разрешительных документах к использованию данной ПЦР-тест-системы и обеспечивает высокую точность и воспроизводимость результатов.

Лабораторная диагностика методом ПЦР - быстрый и надёжный способ выявления возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР-лаборатория даёт ответ через 48 часов с момента доставки материала на исследование. (Чистое время исследования каждого образца составляет всего несколько часов.)

В одном клиническом образце можно одновременно определять наличие более 20 возбудителей.

Важным аспектом при проведении исследования клинического образца является соблюдение правил забора и хранения клинического материала . Приведем здесь лишь некоторые общие рекомендации:

• Забор клинического материала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции (для этого необходимо учитывать входные ворота, пути распространения, места размножения и пути выделения искомых микроорганизмов).
• Количество отделяемого в забранном материале должно быть небольшим (не больше, чем «со спичечную головку»). Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
• Для забора клинического материала необходимо пользоваться только одноразовыми щеточками или тампонами. При внесении клинического материала в лабораторную пробирку с раствором соблюдать стерильность.

Актуальность молекулярной диагностики

Одним из наиболее ярких примеров, демонстрирующих актуальность молекулярной диагностики, является выявление инфицированности папилломавирусами высокого онкогенного риска. Не все папилломавирусы вызывают злокачественный рост. Различают генотипы вирусов, вызывающие рак с большой вероятностью, и так называемые доброкачественные генотипы. К первым относятся генотипы 16, 18 (распространены в нашем регионе), 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 68 (ME180), MM4 (W13B), MM7 (P291), и MM9 (P238A). К доброкачественным относят генотипы 6, 11, 40, 42, 53, 54, 57, 66, и MM8 (P155). Идентификация генотипа папилломавирусов возможна и осуществляется с помощью ПЦР (4,5).

Папилломавирусы типов 16,18 персистируют в клетках плоского эпителия шейки матки, не вызывая клинических проявлений годами (до 5 лет инкубационный период), вплоть до момента образования заметных неоплазий. Ранняя диагностика в таких случаях возможна только при профилактических обследованиях населения с использованием ПЦР. В случае обнаружения ДНК папилломавирусов типов, вызывающих рак с большой вероятностью, пациенту следует обратиться к врачу онкологу, посещать его 1 раз в месяц, следить за клиническими проявлениями. Таким образом, ПЦР в этом случае даёт возможность осуществлять раннюю диагностику, позволяющую предотвратить или не запустить рак шейки матки.

В целом ряде случаев на определённых этапах заболевания возбудителей не удаётся выделить классическими микробиологическими методами. Это происходит в силу того, что микроорганизмы могут находиться внутри эпителиальных клеток, в тканях или слизи (например, для хламидий, микоплазм, уреаплазм, всех вирусов характерна внутриклеточная локализация, а трихомонады и гонококки могут находиться как внутри- так и внеклеточно). Кроме того, некоторые бактерии под влиянием определённых факторов могут переходить в так называемые некультивируемые формы или некультивируемое состояние. Примером может служить научно-медицинское исследование хламидиоза. Сравнивали продолжительность выявления Chlamydia trachomatis в очаге инфекции с помощью методов культуры тканей, прямой флуоресценции, ПЦР (выявление ДНК) и Вестерн-блота (выявление РНК). Установлено, что методы определения нуклеиновых кислот обнаруживают возбудителя в очаге на 4 недели дольше (16 недель против 12 недель после первичной инфекции), чем традиционные методы. В этой работе сделан вывод о возможности перехода хламидий в ходе инфекционного процесса в некультивируемое состояние. В этом состоянии хламидии продолжают вызывать воспаление или персистируют в клетках эпителия, но не выявляются микробиологическим методом (6).

В настоящее время накоплен очень большой материал, свидетельствующий об актуальности молекулярной диагностики, но мы не можем рассматривать другие примеры в силу ограниченности объёма данной публикации.

Стратегия использования методов лабораторной диагностики

На современном этапе развития лабораторной диагностики инфекционных заболеваний очевидна необходимость комплексного подхода, который заключается в использовании различных лабораторных методов для установления этиологического диагноза инфекционного заболевания. Врач решает вопрос об использовании того или иного метода лабораторных исследований после изучения анамнеза и клинических проявлений. Разные сочетания методов используют в зависимости от особенностей биологии возбудителей и их взаимодействия с иммунной системой человека, а также от формы заболевания.

Например, для лабораторной диагностики хламидий, вирусов герпес-группы, токсоплазм анализируют результаты ПЦР- и ИФА-исследований. А при лабораторной диагностике микоплазмоза и уреаплазмоза используют сочетание ПЦР с выделением культур с определением чувствительности к антибиотикам. Для выявления неспецифической условно-патогенной микрофлоры используют микроскопию мазка и микробиологический метод выделения культур.

Врач-клиницист ставит диагноз на основании изучения анамнеза пациента, клинических проявлений и данных лабораторной диагностики.

Литература:

• Инфекции, передаваемые половым путем, №2, стр. 21-24, 2002 год. Урогенитальная хламидийная инфекция. Подходы к диагностике и терапии. Г.А. Дмитриев, ЦНИКВИ МЗ РФ, Москва.
• Учебное пособие. Всероссийский учебно-научно-методический центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию. Москва, 1999 год. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах. В.М. Коршунов,…Л.И. Кафарская,…В.В. Смеянов. МЗ РФ, РГМУ, МИМСР, РМАПО, Москва.
• Инфекции, передаваемые половым путем, №1, стр. 8-15, 2002 год. Современное состояние вопроса о значении Ureaplasma urealiticum в генезе урогенитальных заболеваний. В.И. Кисина, О.С. Загребина, К.И. Забиров, В.В. Мешков. ЦНИКВИ МЗ РФ, ГКБ №47 МЗ, Москва.
• Канцерогенез. Коллекив авторов под редакцией Д.Г. Заридзе. Научный мир, 2000 год, Москва. Вирусы папиллом и их роль в канцерогенезе шейки матки. Ф.Л. Киселев. Онкологический Научный Центр РАМН.
• Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник, под редакцией проф.А.И. Карпищенко, 2001 год, «Интермедика», Санкт-Петербург.
• Infect. Immun., May 1992, 2040-2047, Vol 60, No. 5. Demonstration of chlamydial RNA and DNA during a culture-negative state. SM Holland, … HR Taylor. Division of Infectious Diseases, Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это высокочувствительный специфический метод диагностики вирусных заболеваний, который проводится с помощью молекулярно-генетического исследования крови пациента. Такой метод диагностики способен обнаружить также и наследственные болезни. С помощью ПЦР определяют не только диагноз, а еще и стадию, на которой находится заболевание. Поговорим что такое диагностика инфекций методом ПЦР, узнаем о значениях результатов и многое другое.

Разработчиком метода полимеразной цепной реакции стал американец Кэри Мюллис, создав его в 1983 году. В 1993 году Кэри получил Нобелевскую премию в области химии.

Анализ ПЦР является золотым стандартом в диагностике заболеваний. Без этого метода невозможно было бы постановить окончательный диагноз и, следовательно, применить адекватное лечение. Очень часто анализ стает единственным методом для выявления активных инфекций в организме в то время, как другие методы оказались не эффективными.

Метод полимеразной цепной реакции

Подробнее о методе полимеразной цепной реакции.

В основу теста входит многократное удвоение ДНК или РНК, которое осуществляется с помощью ферментов и проводится в лаборатории. Таким образом образовывается нужное для визуального анализа количество материала. При выполнении ПЦР проводится копирование только нужного участка, который соответствует заданным параметрам.

К примеру, происходит помещение биологического материала человека, в котором вероятно присутствует возбудитель, в амплификатор. Затем, ферменты, добавленные в реактор, связываются с патогеном, и получается синтез копии ДНК и РНК. Копирование ведется несколько этапов, что образует цепную реакцию, образовывая сотни копий из одного генетического материала. После этого лаборанты проводят анализ и сравнивают результаты с информацией в базе данных. ПЦР выдает как качественный, так и количественный результат исследования.

Данный метод широко распространен в медицине, он используется для проведения опытов с мутацией и сращиванием ДНК, а также для других экспериментов.

Преимущества диагностики вирусных инфекций методом ПЦР

• Чувствительность теста очень высока, и может обнаружить даже единичные агенты возбудителя. Чувствительность составляет 10-1000 клеток одного образа материала. Для сравнения можно сказать, что чувствительность микроскопических тестов не превышает 105 клеток;
• Специфичность ПЦР находится на высоком уровне, что дает возможность определить участок РНК и ДНК возбудителя. Таким образом, тест не выдает ложных показателей;
• ПЦР непосредственно обнаруживает агент вируса, возбудителя инфекции в исследуемом образце;
• Тест проводится очень быстро. Уже через 4 часа можно оценить результаты исследования;
• Универсальная методика исследования позволяет обнаружить разные виды возбудителя. Можно использовать одну пробу для выявления нескольких видов агентов возбудителя.
• С помощью ПЦР можно провести доклиническую и ретроспективную диагностику. Доклиническая диагностика выявляет патогены еще до наступления болезни, а ретроспективная делается после перенесенной болезни. Это позволяет проводить исследование в инкубационный период болезни, когда жалоб на здоровье еще нет, но при этом пациент уже заражен вирусом. Также, возможно выявить латентную инфекцию, которая протекает бессимптомно.
• ПЦР можно проводить на основе образцов архивного материала или на основе биологических остатков. Это помогает идентифицировать личность или установить отцовство.

Кроме того, диагностика методом ПЦР в последнее время активно развивается. Так, появляются все более новые тесты для исследования. Таким образом, цена на проведение таких тестов с каждым годом падает, что дает возможность доступа к методу многим лицам.

Анализ

Результаты и сроки анализа ПЦР, проведенных методом полимеразной цепной реакции, выдаются уже через двое суток после сдачи образцов для исследования. Иногда, результаты изготовляются в течение 1 дня.

Правила забора материала для исследования методом ПЦР

Практически все пациенты, которые сдают материал для проведения ПЦР диагностики, могут рассчитывать на достоверные и быстрые результаты. Однако, чистота анализа также зависит и от пациента, собирающего материал. Материал для анализа должен собираться в условиях, исключающих его загрязнение, что может существенно повлиять на объективность результата.

• за сутки до сдачи анализа избегать половых контактов;
• забор крови происходит только утром, натощак, это значит, что нельзя употреблять пищу и напитки перед взятием крови;
• моча для анализа сдается в стерильном контейнере, при этом собирается только утренняя моча.

Для исследования методом ПЦР собирается тот биологический материал, в котором предположительно могут быть патогенные бактерии. Это может быть:

• кровь,
• слюна,
• образцы слизи из слизистых оболочек,
• плацента,
• моча,
• мокрота,
• соскоб,
• околоплодные воды и плевральная жидкость.

Для проведения анализов на половые инфекции, берется образцы выделений из половых органов.

Для берутся образцы крови. Чтобы провести анализ на мононуклеоз берется мазок из зева, для диагностики ЦМВИ – образцы мочи. Спинномозговая жидкость берется для диагностики поражений нервной системы человека.

При внутриутробных инфекциях производят забор тканей плаценты и околоплодных вод.

Результаты анализа

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными и отрицательными. При отрицательном результате анализа ПЦР, организм пациента не подвергался заражения и, следовательно, является здоровым. При положительном результате можно утверждать факт наличия инфекционных возбудителей в организме пациента.

Существует также здоровое носительство бактерий, при котором симптомов заболевания у пациента нет. В таком случае результат ПЦР окажется положительным. Но говорить здесь об активной инфекции нельзя. При этом лечение проводить не нужно, но наблюдаться регулярно у врача необходимо. Такое явление распространено при таких заболеваниях, как ВПЧ, герпес, ЦМВИ и других.
Очень важно помнить, что носитель инфекции может передать ее здоровому человеку. Также, сам носитель может перейти в стадию хронического протекания болезни.

ПЦР диагностика - видео пояснение

Очень важно выполнить полноценное обследование будущей мамы для того, чтобы вовремя провести лечение возможной патологии и предупредить развитие серьёзных осложнений. Одним из таких обследований является анализ на инфекции, передающиеся половым путём , который проводится при помощи метода ПЦР диагностики .

   ПЦР диагностика (полимеразная цепная реакция) - это один из современных и наиболее достоверных методов выявления инфекций в организме человека. Этот метод позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе (исследуемом материале) тот присутствует в незначительной концентрации - всего несколько молекул его ДНК или РНК, что делает этот метод наиболее точным.

   Проводится анализ следующим образом: в пробирке многократно копируют определённый участок ДНК бактерии или вируса, добавляя специальные реактивы. Размножив таким способом клетки возбудителя инфекции, впоследствии легко определить её наличие.

Когда проводят ПЦР диагностику?

   Анализы на инфекции во время беременности обычно берутся при постановке на учёт в женской консультации. К сожалению, не во всех женских консультациях ПЦР диагностика проводится бесплатно. Собственно и не во всех лабораториях проводят ПЦР диагностику. В таком случае врач выдаёт направление в частную лабораторию или клинику.

   Анализ на инфекции в любом случае является очень важным во время беременности. Так как большинство инфекций, которые передаются половым путём, протекает бессимптомно, не вызывая никакого дискомфорта, однако может приводить к серьёзным осложнениям беременности, например, к преждевременным родам , задержке внутриутробного развития плода , порокам развития плода.

   Обследование на половые инфекции обязательно должны пройти женщины, у которых предыдущие беременности прерывались на разных сроках, а также пациентки, в мазках которых обнаружены признаки воспалительного процесса (увеличение количества лейкоцитов).

   Проводить ПЦР диагностику желательно до 12-й недели беременности, так как при наличии заражения врач назначит поддерживающее лечение, которое снижает риск осложнений, а после 16 недель - проведёт полноценное лечение. Примерно через 3 недели после окончания лечения обязательно делается контрольный анализ ПЦР для оценки его эффективности.

Как проводится ПЦР диагностика?

   Мазок на ПЦР диагностику врач-гинеколог берёт специальной щёточкой из канала шейки матки, когда беременная женщина находится на гинекологическом кресле. Эта процедура абсолютно безболезненная. Полученный материал помещается в пробирку со специальной средой и отправляется в лабораторию.

   Какой-либо особой подготовки к проведению анализа не требуется. Желательно для более точного результата в течение двух дней не спринцеваться и избегать сексуальных контактов. Кроме того, мазок берётся не раньше чем через три дня с момента окончания использования влагалищных свечек.

   При помощи ПЦР диагностики выявляются такие инфекции как: хламидиоз, микоплазмоз и уреаплазмоз, герпес, цитомегаловирусная инфекция, папилломавирусная инфекция.

Хламидиоз

   На ранних сроках беременности заражение хламидиозом может привести к выкидышу, может привести к неразвивающейся беременности, к задержке внутриутробного развития плода. На более поздних сроках беременности возможны:

   - поражение плаценты (плацентит) и оболочек плода (хориоамнионит);

   - проникновение хламидий к ребёнку с развитием внутриутробной пневмонии (воспаления лёгких);

   - формирование пороков в развитии плода.

   Ребёнок может заразиться хламидиозом во время родов, проходя через родовые пути матери. При этом чаще всего поражаются глаза новорожденного (происходит развитие хламидийного конъюнктивита), что приводит к серьёзным осложнениям, вплоть до полной слепоты.

   Если хламидиоз был выявлен во время беременности, то обязательно проводится лечение антибиотиками будущей мамы и отца ребёнка. После курса терапии необходимо сдать повторный анализ ПЦР на наличие хламидий.

Микоплазмоз и уреаплазмоз

   Микоплазмы - это группа бактерий, которая включает в себя более 40 видов. Во время беременности обследование проводится на присутствие трёх видов микоплазм:

   - микоплазма гениталиум, микоплазма хоминис, уреаплазма уреалитикум.

   Уреаплазмоз и микоплазмоз часто протекают без каких-либо симптомов. У некоторых беременных женщин могут быть выделения из половых путей.

   Микоплазменная инфекция несёт угрозу выкидыша на ранних сроках беременности, нарушения развития плода, многоводия, дисфункции плаценты, инфицирования плодных оболочек (хориоамнионит), поражения плода (наиболее часто развивается внутриутробная пневмония или поражается нервная система ребёнка).

   При микоплазмозе в 2 - 3 раза возрастает вероятность преждевременных родов. Во время родов прохождение через родовые пути заражённой матери может привести к поражению микоплазмами бронхов или лёгких младенца. Кроме того, микоплазменная инфекция является частой причиной инфекционных осложнений у женщины после родов (например, послеродовый эндометрит - воспаление слизистой оболочки матки).

   Важнейшее значение имеет выявление при помощи ПЦР диагностики микоплазмы гениталиум, так как эта бактерия является для человека абсолютным патогеном. Её присутствие в пробе свидетельствует о хроническом воспалительном процессе и во всех случаях требует антибактериального лечения. Антибиотики назначаются женщине после 16-ти недель беременности, а также её половому партнёру. Через три недели после окончания приёма препаратов обязательно сдаются контрольные анализы ПЦР на микоплазму гениталиум.

   Микоплазма хоминис и уреаплазма не являются абсолютными патогенами, то есть не всегда их выявление говорит о наличии воспалительного процесса и необходимости лечения. Эти бактерии могут встречаться в организме здоровой женщины и входят в состав нормальной микрофлоры влагалища.

   Если во время беременности была выявлена микоплазма хоминис или уреаплазма, то обычно назначаются дополнительные анализы - количественные. Это специальные посевы, которые показывают, в каком количестве бактерии присутствуют в организме женщины. Точкой отсчёта принято считать 10 4 КОЕ/мл. Если количество микоплазм или уреаплазм меньше этого значения, то лечение не проводят. В противном случае беременной женщине и её партнёру назначают антибактериальную терапию, с обязательным повторным анализом ПЦР на эти бактерии через три недели после проведённого курса лечения.

   Кроме того, при решении вопроса о необходимости терапии микоплазмоза и уреаплазмоза учитываются данные ультразвукового исследования. Если концентрация бактерий меньше, чем 10 4 КОЕ/мл, однако при УЗИ выявляются признаки воспалительного процесса в плаценте, плодных оболочках или околоплодных водах, проводится лечение антибиотиками.

Герпес

   Герпес - это вирус, который поражает слизистые оболочки и кожу. Этот вирус распространяется воздушно-капельным, контактным, бытовым, а также половым путём.

   Вирус простого герпеса (ВПГ) бывает двух типов: первый тип вызывает поражение слизистой губ, кожи лица (лабиальный герпес) - ВПГ-1, второй тип чаще поражает слизистую половых органов (генитальный герпес) - ВПГ-2. Однако в некоторых случаях генитальный герпес может быть вызван вирусом герпеса 1-го типа.

   Инфекция герпеса является хронической, то есть после заражения вирус не выводится из организма полностью и присутствует в нём пожизненно, встраиваясь в генетическую цепочку нервных клеток человека.

   Среди признаков заболевания могут быть: болезненность, раздражение и зуд в области половых органов, появление пузырьков и маленьких язвочек на слизистых оболочках. Однако довольно часто болезнь протекает без каких-либо симптомов.

   Во время протекания беременности может произойти как первичное заражение женщины вирусом простого герпеса, так и активация уже имеющейся инфекции - из-за снижения иммунитета, характерного для нормально протекающей беременности.

   При первичном заражении герпесом течение беременности подвергается большому риску осложнений, тяжесть которых определяется в первую очередь сроком беременности. Чем меньше срок беременности, тем серьёзнее осложнения.

   Заражение вирусом герпеса в первые 12 недель очень часто приводит к прерыванию беременности, возникновению у плода пороков развития, инфицированию плода с поражением кожи, печени и нервной системы.

   На более поздних сроках беременности есть риск преждевременных родов, многоводия или маловодия, и также сохраняется вероятность инфицирования плода.

   Гораздо меньшую опасность представляет для беременной женщины обострение хронической формы герпеса. В данном случае риск патологий развития плода будет минимальным. Однако если у будущей мамы генитальный герпес обостряется на момент родов, то существует вероятность заражения ребёнка при его прохождении через родовые пути.

   В случае положительной ПЦР на вирус простого герпеса проводится лечение противовирусными и иммуномодулирующими препаратами.

Цитомегаловирусная инфекция

   Цитомегаловирус (ЦМВ) - это вирус семейства герпесвирусов, все представители которого имеют свойство постоянного нахождения в организме человека после заражения. Сам по себе цитомегаловирус не очень заразен: для его передачи требуются частые и тесные контакты с носителем вирусной инфекции.

   Передаётся данная инфекция воздушно-капельным, бытовым и половым путём. Время от времени вирус может активироваться, интенсивно выделяясь через мочеполовые и дыхательные пути. Заражение цитомегаловирусом чаще всего протекает бессимптомно.

   Первичное заражение цитомегаловирусом во время беременности может привести к возникновению пороков развития у плода, задержке внутриутробного развития, глухоте, умственной отсталости, к недостаточности функции плаценты, прерыванию беременности. Ребёнок может заразиться во время родов (при прохождении через родовые пути) и через материнское молоко (при кормлении грудью).

   Лечение цитомегаловирусной инфекции во время беременности проводят иммунологическими препаратами.

Папилломавирусная инфекция

   В настоящее время известно более 100 различных типов вируса папилломы человека (ВПЧ), которые условно можно разделить на три группы:

   - неонкогенные (не способные вызвать опухолевый процесс);

   - низкого онкогенного риска;

   - высокого онкогенного риска (с большой вероятностью могут привести к раку).

   Передаётся папилломавирусная инфекция, как правило, половым путём, однако возможно заражение во время медицинских манипуляций. Новорожденный может заразиться при прохождении через родовые пути заражённой мамы.

   Наличие папилломавирусной инфекции в организме иногда становится причиной появления кондилом (выросты на слизистой оболочке) в области половых органов, во влагалище, на шейке матки, а также различных поражений шейки матки, вплоть до онкологического процесса.

   Однако чаще всего носительство папилломавирусной инфекции протекает абсолютно бессимптомно. Выявление ВПЧ во время беременности, при отсутствии клинических проявлений, не требует медицинского вмешательства.

   При наличии сопутствующих изменений на шейке матки (например, кондилом) необходимо более пристальное внимание к ней и проведение дообследования - кольпоскопии (осмотр шейки матки при помощи микроскопа) и взятия мазка на онкоцитологию (выявление нетипичных для нормальной слизистой оболочки клеток) для решения вопроса о необходимости лечения шейки матки.

   Мелкие кондиломы также не лечатся во время беременности, удаляются только очень крупные или активно растущие кондиломы, которые могут помешать нормальному рождению ребёнка.

   Заражение папилломавирусной инфекцией с поражением дыхательных путей новорожденного (папилломатозом гортани) во время прохождения через родовые пути происходит достаточно редко. Поэтому наличие мелких кондилом влагалища или наружных половых органов у беременной женщины не является показанием к операции

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 1983 году разработал Кэри Мюллис (США), за что в 1993 году он удостоен Нобелевской премии в области химии.

ПЦР анализ стал для большинства инфекций своеобразным «золотым стандартом». Большинство специалистов сталкиваются с ним практически ежедневно и не представляют без него постановку окончательного диагноза. ПЦР нередко становится единственной реакцией для выявления активных стадий заболевания в те моменты, когда не срабатывают другие бактериологические, вирусологические, иммунологические методы диагностики.

Преимущества ПЦР-диагностики в современной медицине:

Непосредственное выявление присутствия возбудителя (а именно, специфического участка ДНК или РНК возбудителя) в исследуемом образце.
Высокая специфичность позволяет определять уникальный участок ДНК или РНК, характерный для конкретного возбудителя, что исключает возможность ложных реакций.
Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет обнаружить даже единичные клетки возбудителей (вирусов, бактерий). Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в исследуемом образце (к примеру, чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - всего 103-105 клеток).
Разработка универсальной методики ПЦР для обнаружения различных возбудителей. Объектом для исследования методом ПЦР служит генетический материал (ДНК, РНК) возбудителя. Методика позволяет выявлять несколько возбудителей из одной биологической пробы.
Достаточно быстрое получение результата анализа. Полное исследование проводится за 4-4,5 часа, реже – несколько дольше.
Возможность обнаружения патогенов до возникновения симптомов заболевания (доклиническая диагностика) и после прошедшей болезни (ретроспективная диагностика). Примером доклинической диагностики будет обследование в инкубационный период (с момента заражения до возникновения жалоб больного), а также латентная инфекция (когда симптомов нет совсем, а есть только лабораторные данные – ПЦР, к примеру). Одним из важных моментов ПЦР-диагностики является проведение ПЦР в архивном материале или биологических остатках, что важно для идентификации личности или отцовства.

В настоящее время ПЦР-диагностика подвергается существенному развитию. Происходит совершенствование самого метода, вновь и вновь появляются новые разновидности ПЦР, на медицинский рынок поступают новые тест-системы для данной реакции. Благодаря этому стоимость ПЦР-исследований с каждым годом становится доступнее для широкого круга пациентов.

На чем основан метод ПЦР

Основой полимеразно-цепной реакции является многократное удвоение (амплификация) определённого участка ДНК или РНК при помощи ферментов в лабораторных условиях. В результате образуется то количество ДНК или РНК, достаточное для визуального анализа. В ходе исследования копируется только тот участок, который подходит под заданные условия, и только в ситуации присутствия его в исследуемой пробе.

Например, материал для исследования, в котором предполагается наличие фрагментов ДНК или РНК возбудителя (слюна, кровь, моча, выделения из половых органов), помещается в специальный реактор (амплификатор). Далее к нему добавляются специфические ферменты, которые связываются с ДНК или РНК патогена, и происходит синтез ее копии. Это копирование идет в несколько этапов по типу «цепной реакции», и в конечном итоге из одной копии генетического материала могут образоваться сотни и тысячи копий. Затем идет анализ и сравнение результата с имеющейся базой данных о строении различных возбудителей. Посредством ПЦР можно не только выявить тип возбудителя, но и выдать количественный результат анализа, то есть как много возбудителей в организме человека.

Метод ПЦР в настоящее время расширяет круг возможностей проводимых исследований: введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК, и получил широкое распространение в медицине, к примеру, для установления отцовства, появление новых генов и прочее.

Какие инфекции можно выявить с помощью ПЦР-диагностики

1) ВИЧ-инфекция (можно выявить вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1)
2) Вирусные гепатиты А, В, С, G (РНК-HAV, ДНК-HBV, РНК-HCV, РНК-HGV)
3) Инфекционный мононуклеоз (ДНК вируса Эпштейн-Барр -ВЭБ)
4) Цитомегаловирусная инфекция (ДНК-CMV)
5) Герпетическая инфекция (ДНК- вируса простого герпеса ВПГ 1 и 2 типа)
6) ИППП (инфекции, передающиеся половым путем) – уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз,
7) Туберкулез (микобактерия туберкулеза)
8) Онкогенные вирусы – папилломавирусная инфекция (вирус папилломы человека (в том числе его онкогенные виды 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58, и 59)
9) Боррелиоз, клещевой энцефалит
10) Листериоз
11) Кандидоз (грибы рода Candida)
12) Хеликобактерная инфекция (Helicobacter pylori)
и другие

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

При обследовании на инфекции, передающиеся половым путем (ИППП), у мужчин и женщин забираются выделения из половых органов, мазок или соскоб из шейки матки, мазок или соскоб из уретры (мочеиспускательного канала), моча.

При обследовании на инфекции (герпетические инфекции, ЦМВИ, мононуклеоз, токсоплазмоз, гепатиты В, С, ВИЧ-инфекция) на ПЦР забирают кровь.

Для диагностики инфекционного мононуклеоза, ЦМВИ, герпетической инфекции забирается мазок из зева, для обследования на ЦМВИ – моча. Нередко для обследования на поражение нервной системы при ряде исследований забирается спинномозговая жидкость.

В пульмонологии материалом служит мокрота, плевральная жидкость.

При обследовании на внутриутробные инфекции – околоплодные воды, ткани плаценты.

Подготовка к сдаче материала и проведению ПЦР-диагностики

Практически все пациенты, которым проводится ПЦР-диагностика, вправе рассчитывать на достоверный, точный и быстрый результат, зависящий в большой степени от возможности лаборатории, профессионализма врача-лаборанта. Вместе с тем, многие не задумываются, что эта самая достоверность во многом зависит и от нас самих, а именно от рекомендаций лечащего доктора, образа жизни и правильности забора материала. При заборе материала требуются условия, исключающие контаминацию (загрязнение) материала и, соответственно, ставящие под сомнение объективность анализа.

Правильная подготовка к сдаче материала не представляет особых сложностей. Существуют следующие рекомендации врачей для пациентов:

1) не жить половой жизнью за сутки до сдачи материала;
2) кровь для исследования сдается утром натощак (не есть, не пить);
3) при сдаче мочи собирается первая утренняя порция в чистый стерильный контейнер.

Сроки готовности ПЦР-анализа

Окончательный результат готов через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день.

Расшифровка результатов ПЦР

Отрицательный результат ПЦР указывает на то, что в исследуемом материале на момент его сдачи не обнаружено никаких следов инфекционных агентов. Большинство случаев показывает отсутствие инфекции, которую пытались найти в исследуемой пробе.

Положительный результат ПЦР указывает на выявление следов инфекции в исследуемой биологической пробе. С большой точностью положительный результат указывает на наличие инфекции в данный момент времени.

Существуют ситуации, когда ПЦР оказывается положительной, а об активной инфекции говорить нельзя – это так называемое «здоровое носительство» без клинических симптомов болезни, которое не требует лечения, но требует динамического наблюдения у врача. Наблюдается чаще при ряде вирусных инфекций (ВПЧ, ЦМВИ, ВЭБ-инфекция, герпетическая инфекция и другие) в таких материалах как слюна, соскоб цервикального канала, уретры, то есть из местного очага. Однако нельзя забывать, что передача инфекции от носителей здоровым людям возможна, как и возможен переход в хроническую форму болезни с активацией процесса. Если же ПЦР положительна в крови, то это уже не носительство и требует специфического лечения.

Количественный результат ПЦР оценивается только врачом индивидуально для той или иной инфекции отдельно и не имеет общих градаций. На основании количественного результата ПЦР врач может установить степень активности инфекции и выставить стадию болезни, что безусловно отразится на курсе и дозах назначенных лекарственных средств.

Один из последних волнующих вопросов: насколько точна ПЦР-диагностика?

Для ПЦР анализа существует 3 определения:

1. Точность (с высокой долей вероятности возможно выявление или отсутствие инфекции).
2. Специфичность (точность выявления конкретной инфекции).
3. Чувствительность (даже при низком содержании генетического материала возбудителей в исследуемом образце инфекция будет обнаружена).

Полимеразно-цепная реакция практически не выдает ложноположительных результатов (то есть не бывает положительных проб там, где инфекция отсутствует). Ложноотрицательные результаты наблюдаются редко (чаще это связано с отсутствием активной инфекции у человека в данный момент). Например, латентная инфекция, хроническая инфекция вне активности.

Врач инфекционист Быкова Н.И.

Видео о том, зачем и как сдавать анализ ПЦР на инфекции

ПЦР исследование: что это такое? Современный мир переполнен огромным количеством инфекций, обнаружить которые становится все труднее. Причина в том, что они успевают приспособиться и эволюционировать. Имеются традиционные иммунологические, морфологические и биохимические способы диагностического исследования. Инновационным методом обнаружения инфекционных заболеваний сегодня является пцр исследование, благодаря которому можно получить высокоточные результаты.

Такая диагностика является современным способом молекулярной биологии. Она имеет следующую расшифровку - полизная цепная реакция. Рассмотрим подробнее, что она из себя представляет.

Что показывает исследование?

Остановимся поподробнее на вопросе - анализ методом пцр: что это такое? При таком исследовании удается определить различные вирусные и бактериальные инфекции.

Такая диагностика очень эффективна при обнаружении скрытых, хронических инфекций. Что показывает анализ пцр? Обследование таким методом позволяет определить патогенный агент при наличии единичных клеток бактерий и вирусов.

Рассмотрим, какие анализы входят в пцр:
. хламидия;
. микоплазмы;
. уреаплазмы (уреалитикум и парвум);
. возбудитель гонореи;
. разнообразные типы вируса папилломы человека;
. трихомонады;
. гарднереллы;
. кандида.

Если необходимо обнаружить инфекционные заболевания половых органов, то ответом на вопрос, исследование методом пцр что это, служит взятие биоматериала из цервикального канала, влагалища и уретры.

Подготовка к зачатию - это очень важные мероприятия, которые требуют большую ответственность. При планировании стать родителями в обязательном порядке необходимо сдать пцр анализ, если имеется подозрение на наличие инфекционного заболевания.

Если беременность уже имеется, то такую диагностику следует отложить. Важно отметить: знать, что значит пцр анализ и сдать его должна не только будущая мама, но и папа.

Что выявляет пцр? Имеются следующие виды возбудителей недуга:

• вирус гепатита В и С;
• возбудители туберкулеза;
• вирусы семейства герпес;
• хеликобактерная инфекция.

Процесс проведения диагностики

Как проводится анализ пцр? Такая диагностика может быть выполнена при помощи различных биологических материалов, состав которых предусматривает микробы.

Ведь точность анализа пцр зависит от того, как правильно собран материал, и выбрана пробоподготовка:

1. Обнаружение половых инфекций в качестве материала для анализа выступают выделения из половых органов: из шейки матки, мочеиспускательного канала и моча.
2. Важно понимать, кровь на пцр — это биологический материал, необходимый для определения гепатита С и ВИЧ инфекции. Благодаря использованию современным вакуумным системам, процесс забора крови стал минимально травматичным и максимального изолированным от окружающей среды.
3. Анализ слюны на пцр позволяет диагностировать инфекционный мононуклеоз. Очень важно знать, как берется методом пцр биологический материал, и какие именно биоматериалы необходимы для обнаружения требуемого заболевания. Данные о том, что входит в анализ пцр нужно уточнить у врача до проведения диагностики.

Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой.

Результаты пцр анализа можно получить уже на следующее утро, и вот что они могут означать:

1. Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель.
2. Пцр положительный обозначает, что в организме человека присутствует ДНК или РНК возбудителя.

Чтобы понять, что означает анализ пцр, необходимо произвести количественное определение микроорганизмов. Это целесообразно выполнять при болезнях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Причина в том, что такие возбудители показывают свое отрицательное влияние только при избыточном количестве.

Когда вы поняли, что значит метод пцр, можно сделать вывод: такая диагностика лучше всех позволяет получить информацию о присутствии определенного типа инфекции.